實驗收費標準:
項目編號 | 項目名稱 | 計價單位 | 單價 |
ZC1102 | WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)) | 個 | 140元 |
WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)服務介紹:
通過電泳區分不同的蛋白組分,并轉移至固相支持物(膜),通過特異性試劑(抗體)作為探針,對靶物質進行檢測。可檢測到低至1~5ng(Low可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。
實驗結果展示:
WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)實驗流程:
Western Blot實驗步驟
1、 細胞總蛋白提取
(1)對于懸浮細胞: 離心收集細胞,每106細胞加250 ul RIPA(在使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑),振蕩。如果需要提高蛋白濃度,可以適當減少細胞總蛋白提取試劑體積。
(2) 對于貼壁細胞:
① 用TBS沖洗細胞2-3次。最后一次*吸干殘留液。
② 加入適當體積的 RIPA(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑)于培養板、瓶內3-5min。期間反復晃動培養板、瓶,使試劑與細胞充分接觸。
③ 用細胞刮刀將細胞及試劑刮下,收集到1.5ml離心管中。
(3) 冰浴30min,期間用移液器反復吹打,確保細胞*裂解。
(4) 12000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
2、 組織蛋白提?。?/span>
(1) 組織塊用冷TBS洗滌2-3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑(使用前數分鐘內加入蛋白酶抑制劑)冰上*勻漿。如果需要提高蛋白濃度,可以適量減少該試劑體積。
(2) 將勻漿液轉移至1.5ml離心管中,振蕩。冰浴30min,期間用移液器反復吹打,確保細胞*裂解。
(3) 12000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。
3、 蛋白濃度測定:BCA法側蛋白濃度
4、 SDS-PAGE電泳
(1) 清洗玻璃板
(2)灌膠與上樣
① 將玻璃板對齊后放入夾中卡緊,操作時要使兩玻璃對齊,以免漏膠。
② 按實驗安排配制分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。大約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。
分離膠配比
分離膠濃度 | ||||||||||||
試劑 | 8% | 10% | 12% | 15% | 18% | 20% | 8% | 10% | 12% | 15% | 18% | 20% |
H2O ml | 4.63 | 4 | 3.3 | 2.3 | 1.3 | 0.63 | 6.9 | 5.9 | 4.9 | 3.4 | 1.9 | 0.9 |
30%丙烯酰胺(29:1) ml | 2.67 | 3.3 | 4 | 5 | 6 | 6.67 | 4 | 5 | 6 | 7.5 | 9 | 10 |
1.5M TRIS-Hcl(PH 8.8) ml | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 | 3.8 |
10%SDS ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
AP ml | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 |
TEMED ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul | 7.5ul |
總體積 ml | 10ml | 15ml |
5%濃縮膠配比 | ||||
試劑 | 濃度 5% | |||
H2O ml | 2 | 3 | 4 | 6 |
30%丙烯酰胺(29:1)ml | 0.5 | 0.75 | 1 | 1.5 |
1M TRIS-Hcl(PH 6.8)ml | 0.5 | 0.75 | 1 | 1.5 |
10%SDS ul | 40 | 60 | 80 | 120 |
AP ul | 30 | 45 | 60 | 90 |
TEMED ul | 4ul | 6ul | 8ul | 12ul |
總體積 ml | 3ml | 4.5ml | 6ml | 9ml |
③ 按前面方法配5%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。
(3) 加足夠的電泳液后上樣電泳。將樣品加入電泳孔中,電泳。濃縮膠電壓75V,分離膠用120V。電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳,進行轉膜。
5 轉膜 (小于20kd的蛋白請使用0.22um的PVDF膜。)
(1)準備6張7×9cm的濾紙和一張大小適中的 PVDF膜,PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。
(2) 在加有轉移液的盆里放入轉膜用的夾子,兩塊海綿墊,一支玻棒,濾紙和經過活化的PVDF膜。
(3)將夾子打開使黑的一面保持水平。在墊子上墊海綿、三層濾紙。
(4)小心剝下分離膠蓋于濾紙上,將膜蓋于膠上,并除氣泡。在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊。
(5)轉膜條件(濕轉)
① 快轉。300mA恒流轉膜半小時,或者200mA轉膜1小時,時間可以略微調整,時間對應調整。
② 慢轉。轉膜過夜,25V恒壓轉膜過夜。
6 免疫反應
① 將轉好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配),封閉1h。
① 稀釋一抗(TBST溶解的5%脫脂牛奶,磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA),4℃孵育過夜(快轉),或者4℃孵育抗體3小時(慢轉)。
③用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次5min
④ 將二抗用TBST稀釋3000倍,室溫下孵育30min后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次,每次5min
7 化學發光 將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合,將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸,1-2min后,去盡殘液,包好,放入暗匣中曝光。最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。根據不同的光強度調整曝光條件。
8 凝膠圖像分析 將膠片進行掃描存檔,PhotoShop整理去色,Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值。
蛋白樣品制備的注意事項:
1、細胞數量達5×106
2、將細胞裂解液再離心,收集上清液,加loading煮樣5min。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項:
1、做膠:防止漏膠、進氣泡以及花膠(水封、插梳子和拔梳子)
2、加樣:兩邊加loading,加樣量一樣,加樣時間要盡量短,以免樣品擴散。
3、電泳:將膠夾好放于電泳槽中,加電泳buffer(內外面不能聯通),將電壓調到90V開始電泳。
轉膜注意事項:
1、泡膜:轉膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉移buffer浸泡20min。(1.凝膠若是沒在預冷的轉膜buffer中浸泡,就會在轉膜過程中出現凝膠皺縮,導致出現轉移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡)
2、轉膜順序:陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板
3、轉膜條件:0.35A 250V 1h40min 冰浴中進行轉膜(具體轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定;目的蛋白的分子量越大,需要的轉膜時間越長,反之則短)
4、避免直接用手碰雜交膜,使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率并會使膜臟掉。
5、夾好膜和凝膠后,確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在,否則會導致轉膜不*。
6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣,過大和過小都會影響轉膜效率。
7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結合能力,從而產生較高的背景,故如果選擇雞來源的抗體最好使用硝酸纖維素膜(NC膜)
關于磷酸化蛋白檢測的注意事項:
1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態!在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑(NaF,可以防止去磷酸化),并將標本時刻保持在冰浴中!
2、使用5%的BSA作為封閉試劑!不能使用脫脂奶粉!(因為脫脂奶粉中含有酪蛋白,會出現很高的背景)。
抗體保存注意事項:
1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存!
2、對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃
(1)分裝的量以一次實驗用完為好,最少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。
(2)復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來!
(3) 絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。
3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。
4、長期保存,加入疊氮鈉,防止細菌污染。
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