免疫熒光（IF），是應用抗原與抗體特異性結合的原理，通過熒光標記抗體對組織細胞內抗原進行定位、定性及定量的研究。目前科沿有道主要可以對石蠟切片、冰凍切片、細胞爬片、組織芯片進行免疫熒光檢測。科沿有道目前已突破傳統的免疫熒光雙標限制，開發出多色免疫熒光技術。

實驗流程：

冰凍切片免疫熒光實驗步驟

1、 冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

2、 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中低火5min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。（修復液和修復強度根據組織來確定）

3、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

4、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

5、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

6、 DAPI復染細胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

7、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

8、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm；FITC綠光激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm；CY3紅光激發波長510-560，發射波長590nm）

石蠟切片免疫熒光實驗步驟

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH9.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火至沸后斷電間隔10min中低火至沸，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定）

3、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

4、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

5、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

6、 DAPI復染細胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

7、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

8、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm；FITC綠光激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm；CY3紅光激發波長510-560，發射波長590nm）